Proimmunotoxin: a novel design strategy of immunotoxins applied to breast cancer

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018Breast cancer is the second leading cause of death among female cancer patients. One of the most used therapies against receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 (HER2)+ metastatic breast cancer is the monoclonal antibody Trastuzumab. This antibody can be used in therapy either alone or in conjugation with chemotherapeutics. Though it has shown to lead to an increase in patient’s overall survival, this therapy may also lead to the acquirement of resistance in patients with prolonged usage. Immunotoxins have been pursued for a long time as a new and innovative type of biopharmaceutical against cancer because they combine the cytotoxicity of a variety of toxins with the specificity of antibodies. An immunotoxin combining Ricin A-chain [Ricin A] and an antibody targeting breast cancer has already been tried as a therapeutic. However, the observed non-specific toxicity prevented further studies. To address the problem of nonspecific toxicity observed in immunotoxins, one possible solution could be the neutralization of the active toxin during blood circulation. Recently, variable domain from alpacas heavy chain antibody (VHH), targeting Ricin A, have been described to effectively neutralize Ricin toxin in vitro and to protect mice from Ricin toxicity in vivo. Taking in consideration these concepts, a new type of immunotoxin could be envisioned. A proimmunotoxin which comprises Trastuzumab linked to a Ricin A neutralizing VHH, may be capable of delivering Ricin A toxin with high specificity to HER2+ breast cancer cells, while neutralizing its activity during blood circulation, overcoming the non-specific toxic side effects of a normal immunotoxin and resistance to Trastuzumab. The results here presented show that this new type of immunotoxin retains the specificity of the antibody Trastuzumab towards HER2, shows affinity towards Ricin A, and most importantly, it can protect HER2- cells, while retaining the ability to deliver Ricin A toxin to HER2+ breast cancer cells, decreasing cell viability. The possibility of clustering HER2 at the cell membrane to enhance the internalization and trafficking of the proimmunotoxin was also studied by constructing one with two different binding sites to HER2. Preliminary results show that this proimmunotoxin has a quicker internalization by the cells, shown by an enhanced decrease in cell viability.De acordo com a American Cancer Society, é estimado que o cancro da mama provoque aproximadamente 40,920 mortes em 2018, apenas nos Estados Unidos da América. Este tipo de cancro é a segunda maior causa de morte entre mulheres diagnosticadas com cancro, mas pode também afetar homens. A doença pode ser classificada em diversos subtipos, sendo que o cancro da mama HER2+ afeta entre 20% a 30% das mulheres que sofrem desta doença. Este é caracterizado pela sobrexpressão ou amplificação do gene c-erbB-2, que codifica para o recetor tipo 2 do fator de crescimento epidérmico humano, cuja função principal é a regulação do crescimento celular. A sobrexpressão de HER2 leva a um crescimento celular descontrolado que aumenta a probabilidade de metastização de células cancerígenas, aumentando a taxa de mortalidade e levando a um pior prognóstico dos doentes diagnosticados com cancro da mama HER2+. A terapia mais recorrente em doentes com cancro da mama HER2+ é o anticorpo monoclonal Trastuzumab, sendo que esta terapia pode ser feita com ou sem a administração de outros fármacos. Este anticorpo exerce o seu efeito terapêutico ligando-se ao recetor HER2 impedindo a transdução de sinal através da via PI3K/Akt e aumentando a sua internalização e possível degradação. Este anticorpo promove também o recrutamento de células imunitárias, como por exemplo as células Natural Killer (NK), através de um mecanismo mediado pelo recetor CD16. O principal problema com a utilização deste tratamento é a necessidade de um uso recorrente do mesmo, o que leva muitas vezes à aquisição de resistência à terapia por parte destes doentes. De forma a aumentar a citotoxicidade de anticorpos monoclonais utilizados na terapia contra o cancro, tem-se recorrido a técnicas de biologia molecular para combinar anticorpos ou fragmentos dos mesmos com toxinas - estas novas moléculas são denominadas de imunotoxinas. A vantagem destas imunotoxinas na terapêutica contra o cancro é que comparativamente aos anticorpos terapêuticos que as constituem, conseguem promover um aumento da citotoxicidade através da junção de uma grande variedade de toxinas, mantendo a especificidade para os seus alvos terapêuticos, permitindo assim a sua distribuição às células cancerígenas. De entre as toxinas que podem ser utilizadas para a construção de imunotoxinas, a Ricina, proteína de origem vegetal extraída da planta Ricinus communis L., é uma das que mostra maior relevância devido à sua potente citotoxicidade. Esta proteína é constituída por duas cadeias polipeptídicas, a cadeia A é conhecida pela sua capacidade de depurinação de uma base de adenina na subunidade 28 do RNA ribossomal, causando a inativação dos ribossomas e consequentemente à paragem da síntese proteica, levando à morte das células por apoptose. Sendo a cadeia A a componente tóxica desta toxina, a cadeia B está encarregue da entrada da toxina na célula, através da sua ligação a resíduos de galactose presentes na superfície das células. Até hoje já foram testadas várias imunotoxinas que combinam a toxina Ricina com anticorpos que têm como alvo o cancro da mama e, apesar de mostrarem bons resultados iniciais, os efeitos de toxicidade não-específica observados em pacientes após a administração destes biofármacos impedem a sua comercialização. Uma possível solução aos efeitos observados pode passar pela neutralização da toxina ativa durante a sua circulação sanguínea. A descoberta de anticorpos formados apenas pela sua cadeia pesada em camelídeos revolucionou o conceito de anticorpo monoclonal e permitiu a construção de novos fragmentos de anticorpo, os fragmentos variáveis da cadeia pesada de camelídeos, ou em inglês variable domain of camelid heavy chain antibody (VHH). Os VHH além de manterem a especificidade dos anticorpos monoclonais têm como vantagem adicional a sua reduzida dimensão, o que permite um grande número de aplicações que não seriam possíveis com anticorpos monoclonais. Vance D. J. e os seus colaboradores construíram recentemente monómeros e heterodímeros de VHHs que são capazes de neutralizar eficazmente a Ricina in vitro e proteger ratinhos da sua toxicidade in vivo, tendo como alvo quer a cadeia A como a cadeia B desta toxina. Através dos conceitos apresentados acima, é possível idealizar um novo conceito de imunotoxina. Em vez de utilizar a convencional construção de imunotoxina, cujo anticorpo se encontra diretamente ligado à toxina, o anticorpo irá encontrar-se ligado a VHHs anti-toxina que irão não só neutralizar a mesma durante a sua circulação sanguínea, mas também entregar especificamente a toxina às células. Neste projeto apresentamos um novo conceito de imunotoxina, uma proimunotoxina, que irá fundir o anticorpo Trastuzumab a dois homodímeros VHH anti-Ricina A, que será capaz de entregar a cadeia A da toxina Ricina especificamente a células de cancro da mama HER2+, tentando desta forma evitar os efeitos de toxicidade não específica. A criação de uma proimunotoxina permitiu em paralelo o estudo de uma construção similar com o objetivo de aumentar a sua internalização através do clustering de recetores HER2 à superfície da célula, de forma similar ao que foi feito por Moody, P. R. et al. Inicialmente procedeu-se à construção de dois anticorpos, Tras-VHH-R, constituído pelo anticorpo Trastuzumab em formato scFv-Fc que se encontra ligado pela região Fc a dois homodímeros VHH anti-Ricina A e o anticorpo Tras-VHH-R-H, constituído também pelo anticorpo Trastuzumab no mesmo formato ligado a dois heterodímeros, constituídos por um VHH anti-Ricina A e um VHH anti-HER2, que na presença de Ricina A constituem a proimunotoxina 1 (PIT1) e proimunotoxina 2 (PIT2), respetivamente. Estes anticorpos foram produzidos em células 293-F FreeStyle™ e eficazmente purificados através de cromatografia de afinidade com colunas de Proteína A Sepharose. A afinidade relativa dos anticorpos Tras-VHH-R e Tras-VHH-R-H para com a cadeia A da toxina Ricina foi estudada utilizando um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), revelando baixos valores EC50 para ambos os anticorpos demonstrando uma alta afinidade à cadeia A de Ricina, que se deve exclusivamente aos VHHs anti-Ricina A presentes na sua constituição. O estudo da especificidade destes anticorpos para com o recetor HER2 foi estudado através de citometria de fluxo, demonstrando resultados similares entre os anticorpos contruídos neste projeto e o anticorpo Trastuzumab, com valores superiores a 95 % de células marcadas para a linha celular SKBR3 (HER2+) e inferiores a 2 % para a linha celular HeLa P4 (HER2-), para concentrações de anticorpo superiores a 0.8 nM. Por último, a citotoxicidade das proimunotoxinas foi testada através de um ensaio de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil tetrazolium). Células SKBR3 e HeLa P4 foram incubadas com Ricina A, anticorpo (Tras-VHH-R ou Tras-VHH-R-H) e PIT 1 ou 2 a diferentes concentrações separadamente, durante períodos de 48 ou 72 h. Os resultados de viabilidade celular obtidos confirmam a existência de concentrações de PIT 1 e 2 para as quais a viabilidade celular na linha celular SKBR3 é inferior a 60% mantendo a viabilidade celular superior a 90 % na linha celular HeLa P4, demonstrando que as PIT construídas neste projeto são capazes de matar células cancerígenas HER2+, protegendo as células HER2-. Comparando a PIT1 com a PIT2 é possível perceber uma diferença significativa na viabilidade celular entre as duas PIT, sendo que a PIT2 demonstra resultados de viabilidade celular inferiores à PIT1 em diferentes concentrações. Com base nestes resultados preliminares é possível concluir que o clustering de recetores HER2 à superfície da célula é capaz aumentar a internalização de proimunotoxinas e possivelmente ajudar no seu tráfico intracelular e por consequência na libertação da toxina dentro da célula. A aplicação deste conceito noutros veículos de transporte biológico de toxinas ou fármacos por anticorpos pode ser muito importante no aumento da sua eficácia e diminuição da sua toxicidade inespecífica. No futuro esperamos poder continuar com ensaios de internalização celular e microscopia confocal de forma a compreender melhor o modo como estas proimunotoxinas são internalizadas e o seu percurso no interior da célula. Ensaios de morte celular serão posteriormente realizados de forma a perceber quais as vias de morte celular que são ativadas aquando da libertação da toxina. Seria também muito importante começar os estudos em linhas celulares resistentes ao Trastuzumab de forma a poder viabilizar este novo biofármaco ao maior conjunto de pacientes possível. O que torna este conceito de proimunotoxina tão interessante é a possibilidade de ser aplicado a um grande conjunto de anticorpos e toxinas, mas também ao transporte de fármacos. Desta forma, esperamos que as experiências efetuadas neste trabalho possam contribuir para o avanço da disponibilização de novos e potentes biofármacos contra o cancro da mama

Educational Policy and Open Resources in Brazil: a Discursive Analysis

Discourse analysis is the French theoretical and methodological foundation of our research, in which we analyze the discursive operation of Open Educational Resources focusing on its potential destabilization effects in accessing cultural goods, educational assets and authoring processes. We understand that Open Educational Resources may become an educational policy, based on the principles of collaboration and openness, giving new meaning to the senses of authorship and learning materials. The current challenge is to intensify actions for a public debate on the relevance of open access. (Funded by São Paulo Research Foundation – FAPESP)

An overview of vocatives in European Portuguese

This paper aims to provide a short presentation of the vocative phrase in European Portuguese, to which very little attention has been paid in the literature. The main contribution of this paper is the argument that certain pragmatic markers involved in direct addresses should be considered for their syntactic function within the vocative phrase, rather than being treated as independent interjections. In this respect, the data allow me to draw the reader’s attention to the grammaticalization process that produces such pragmatic markers. The presentation of the vocative phrase in European Portuguese is organized according to the way it encodes the pragmatic features of the direct address in this language. As the encoding of the direct address is cross-linguistically diverse, this presentation will allow linguists who work on vocatives in other languages to exploit my European Portuguese data for comparative studies in pragmatics or in morpho-syntax

Antimicrobial activity of phenyl isothiocyanate on escherichia coli and staphylococcus aureus cells in planktonic and biofilm states

Tese de mestrado integrado. Bioengenharia. Universidade do Porto. Faculdade de Engenharia. 201